漸漸習慣了現代生活的美國隊長史蒂夫·羅傑斯（克里斯·埃文斯Chris Evans飾），在一次行動後隱隱嗅到神盾局內部所瀰漫出來的凶險氣味。而當得知神盾局正秘密進行的“洞察計劃”後，他更為此感到憤怒。某天，神盾局指揮官尼克-法瑞（塞繆爾·傑克遜Samuel L. Jackson飾）遭到一群武裝分子襲擊，他拼盡全力將一支U盤交到美國隊長手中，這裡面藏著該局二戰以來最重要且最可怕的秘密。在此之後，美國隊長因涉嫌殺害尼克而遭到前局長亞歷山大·皮爾斯（羅伯特·雷德福/Robert Redford飾）的通緝和追殺，逃亡中他得到黑寡婦（斯嘉麗·約翰遜Scarlett Johansson飾）和退伍老兵“獵鷹”（安東尼·麥凱Anthony Mackie飾）的幫助。